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“ju111net手机版生物”产品文献:白藜芦醇与伊马替尼协同作用对细胞生物学行为的影响

点击次数:9 发布时间:2019/11/8
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白藜芦醇与伊马替尼协同作用对 K562
细胞生物学行为的影响*
王晓军1 茹甫毅1 吴双有1 朱卫民1 田培军1


[摘要] 目的:探讨白藜芦醇对人白血病细胞增殖的影响及机制。方法:采用不同浓度白藜芦醇及伊马替尼对 K562细胞进行干预,通过 MTT法、台盼蓝染色观察细胞增殖,caspase-3活 性 检 测、Hoechst33258染 色 及 流式细胞术观察细胞凋亡情况和细胞增殖抑制率,利用中效原理计算出各时间段内白藜芦醇、伊马替尼对 K562细胞增殖抑制的中效浓度,以检测二者有无联合增效作用。结果:不同剂量白藜芦醇、伊马替尼单独作用和联合作用对 K562细胞均有生长抑制作用,在一定范围内呈剂量、时间依赖性,2种药物联合有协同增效作用。随着白藜芦醇或伊马替尼浓度升高,其caspase-3活性逐渐增强。白藜芦醇、伊马替尼单独作用和联合作用对人白血病细胞 K562均 有 凋 亡 作 用,且联合用药组随着白藜芦醇或伊马替尼浓度的增加,K562细胞的凋亡率也逐渐增 加。
结论:白藜芦醇及伊马替尼对白血病 K562细胞株均有促进凋亡作用,联合用药可明显增加其凋亡率。
[关键词] 白血病;白藜芦醇;伊马替尼;凋亡
白藜芦醇本质是一种活性非黄酮多酚化合物的新型抗癌 剂,近年研究发现白藜芦醇对ru腺癌、前列腺癌、皮肤癌等多种肿瘤细胞的生长均具有显著的抑制作用,同时也对人白血病细胞具有明显抑制生长作用,是非常有前景的天然抗肿瘤药物。但是其抑制肿瘤细胞生长的具体机制比较复杂,文献* 基金项目:陕西省卫生科研项目(No:D80) 1安康市中心医院(陕西安康,725000)通信编辑:茹甫毅,E-mail:ryanfore@126.com报道较少。为了解白藜芦醇在抗白血病中的作用,大家观察了白藜芦醇对人白血病细胞 K562生长的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 人白血病 K562细胞株购自南京科佰生物科技有限企业。
1.1.2 细胞培养液 本实验所用 RPMI-1640细胞培养 液 含 有 10% 灭 活 胎 牛 血 清,100 U/mL 青 霉素,100U/mL链霉素。· 507 ·临床血液学杂志 第30卷
1.1.3 主要试剂 RPMI-1640细胞培养液购自美国 Gibco企业;台盼蓝购自ju111net手机版_ju111net登录_ju111.net登录导航;MTT 检 测 试 剂 盒 购 自 Amresco公 司;白 藜芦醇购自西安奥特斯生物制品有限企业;伊马替尼(瑞士 NOVARTIS企业);caspase-3活性检测试剂
盒购自 Chemicon企业。
1.2 方法
1.2.1 实验分组 将 K562细胞株分为空白对照组、伊马替尼单药组(0.1、0.2μmol/L)、白藜芦 醇单药组(50、100、200μmol/L)、伊马替尼联合白 藜芦醇 组 (伊 马 替 尼 0.1 μmol/L+ 白 藜 芦 醇 50μmol/L、伊 马 替 尼 0.1μmol/L+ 白 藜 芦 醇 100μmol/L、伊 马 替 尼 0.1μmol/L+ 白 藜 芦 醇 200μmol/L、伊 马 替 尼 0.2 μmol/L+ 白 藜 芦 醇 50μmol/L、伊 马 替 尼 0.2μmol/L+ 白 藜 芦 醇 100μmol/L、伊 马 替 尼 0.2μmol/L+ 白 藜 芦 醇 200μmol/L)。上述每组细胞均设置6个复孔。1.2.2 药品制备 白藜芦醇及伊马替尼片剂分别采用二甲基亚砜进行溶解,按浓度为10mg/ml配制原液,在生理盐水稀释,稀释浓度为20μmol/L。另外250mg的 MTT 粉剂溶于50mlpH 为7.4的 PBS液 中。所 有 液 体 均 过 滤 分 装,保 存 条 件 为-20℃。
1.2.3 细胞培养 将 K562细胞培养在含10%胎牛血清、100 U/mL 青 霉 素、100pg/mL 链 霉 素 和2mmol/L谷 氨 酰 胺 的 RPMl-1640 培 养 液 内,于375%CO2 饱 和 湿 度 条 件 下 培 养,每2~3d传代1次。细胞处于对数生长期时用于实验。1.2.4 MTT 法检 测 细 胞 增 殖 收集对数生长期的 K562细胞于37℃、5%CO2 细胞培养箱中培养,分别于24、48、72h时加入20μlMTT 溶液(5mg/ml),继续于37℃、5%CO2 培养箱中孵育4h,随后弃掉 细 胞 培 养 液;向 每 个 细 胞 培 养 孔 中 分 别 加 入150μlDMSO,用脱色摇床振荡10min,随后用酶联免疫检测仪,使结晶物充分溶解;选择570nm 波长(A570),以空白孔调零,于酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度并记录结果,计算细胞增殖抑制率,公式为:细胞增殖抑制率=1-实验孔A570/对照孔A570。1.2.5 台盼蓝拒染实验 按照1.2.1中的分组将相应药物加 入 至 各 组 细 胞 培 养 孔 中,作 用48h后用移液器吹打细胞使之制成单细胞悬液;将各组细胞悬液作适当稀释后用台盼蓝进行染色,具体操作为细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液按照9∶1比例混合均匀,随后在3min内用细胞计数板统计活细胞数和死细胞数;选择各组作用的zui
佳浓 度,分 别 用该浓度作用于 K562细胞,并分别于24、48、72h时检测细胞的存活率。

1.2.6 中效浓度的计算 存活率(fu)=药物实验组A 值/细胞对照组A 值,抑制率(fa)=1-存活率(fu)。将中效方程fa/fu=(D/Dm)m 两边取对数,得lg(fa/fu)=lg(D/Dm)m=mlgD-mlgDm。设a=-mlgDm、Y=lg(fa/u)、X=lgD,则 Y=mX+a。其中 D为药物浓度,Dm 为中效浓度,即抑制率为50%时的药物浓度(IC50),m 为斜率,a为截距。

1.2.7 Hoechst33258染 色 实 验 收 集 细 胞,PBS洗,Hoechst33258染 色37℃ 30min,制 片 荧 光 显微镜观察细胞核形态变化并拍照。
1.2.8 Caspase-3活性 检 测 细 胞 按caspase-3试剂盒的要求处理,参考 Chemicon企业的caspase-3酶活力单位的定义,即一个酶活力单位表示为当底物 处 于 饱 和 状 态 下 时,在 37℃1h 内 可 以 剪 切1nmol Ac-DEVD-pNA 产 生 1 nmol pNA 的caspase-3酶量,由此就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase-3。
1.2.9 流 式 细 胞 术(AnnexinV-FITC/PI双 染 色法)检测各组细胞凋亡情况 通过血清饥饿法对K562细胞行同步化处理,各组药物作用48h后收集对数生 长 期 的 K562细 胞,PBS 洗 涤 3 次,加 入5μl的 AnnexinV-FITC和1μl的 PI混均,避光孵育10min,PBS洗涤1次,每管加入400μl的PBS,采用流式细胞仪检测凋亡细胞,计算细胞凋亡率。
1.3 统计学处理
数据 均 使 用 Excel表 格 进 行 录 入,同 时 采 用SPSS20.0软 件 对 数 据 进 行 统 计 学 分 析。数 据 以x珚±s表示,两样本间的平均数比较使用独立样本t检验,多 组 样 品 间 的 均数 比 较 使 用 单 因 素 方 差 分析,检验水准α=0.05。

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